Messa a punto di un sistema di diagnosi NGS in grado di ottenere informazioni sullo stato di infezione virale/viroidale di varietà di crisantemo importanti per il Ponente Ligure e di un sistema di protocollo per il risanamento di varietà a rischio di estinzione
Florcoop Sanremo / CREA-OF di Sanremo / IPSP-CNR di Torino
Programma Regionale di Sviluppo Rurale 2014-2020 della Regione Liguria – Misura 16.01
Aiuti per la costituzione e l’operatività dei gruppi operativi del PEI Attuazione del progetto dei Gruppi Operativi – 2° fase “Settore Agricolo”
Esistono diverse varietà di crisantemo da fiore reciso considerate ancora molto appetibili dal punto di vista commerciale ma che ormai non sono disponibili nei cataloghi dei costitutori sia olandesi sia danesi. La continua propagazione agamica, infatti, ha favorito la diffusione e il perpetuarsi di malattie virali che hanno fatto perdere a queste varietà le loro caratteristiche positive. Il progetto CRIREC è intervenuto su questo problema, applicando le tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS) per indagare e caratterizzare il viroma del crisantemo e supportare il risanamento delle varietà Dilana, Snowdon e Turner al fine di renderle disponibili ai coltivatori liguri.
Per arrivare al risanamento delle varietà di crisantemo, infatti, è fondamentale conoscere i virus e i viroidi che infettano questa pianta in modo da poterli diagnosticare e verificare la loro assenza nelle piante risanate. Le tecnologie NGS, dette anche tecnologie di sequenziamento in parallelo, permettono di sequenziare grandi quantità di materiale genetico in un tempo ristretto e a costi ridotti. Con queste tecnologie è stato possibile ottenere le informazioni relative alle sequenze virali e viroidali presenti in un ampio numero di campioni di crisantemo raccolti dal 2017 al 2021 sul territorio ligure e ricostruire il viroma di questa pianta, ossia l’insieme di virus e viroidi in grado di infettarla.
Il grande vantaggio delle tecnologie NGS è che esse permettono di individuare non solo le entità virali già conosciute ma anche virus e/o viroidi non ancora noti in assoluto o che non sono mai stati diagnosticati in crisantemo.
In breve la tecnologia NGS è illustrata qui di seguito. Gli acidi nucleici estratti dai campioni vegetali di interesse vengono frammentati ed “amplificati” in modo non specifico; le sequenze ottenute vengono quindi assemblate in sequenze più grandi (i “contigs”) che vengono confrontati con le sequenze presenti nel database in cui sono archiviate tutte le sequenze disponibili di ogni organismo. A seguito di questo confronto, fatto da elaboratori elettronici, in quanto il confronto si basa su milioni di dati, si individuano i virus noti presenti nei campioni analizzati (perché presentano una identità di sequenza molto alta, vicino al 100%) e si individua la presenza anche di virus simili a virus noti ma non identici e virus anche molto diversi, che costituiscono nuove specie virali mai descritte prima.
In particolare, l’indagine fatta durante il progetto CRIREC ha permesso di ricostruire il genoma di tre potenziali nuovi virus, appartenenti ai generi Pecluvirus, Oleavirus e Solendovirus, per i quali sarà svolta una successiva caratterizzazione.
La stessa tecnica NGS è stata poi impiegata per indagare le entità virali rimaste dopo il trattamento di risanamento nelle piantine di crisantemo delle varietà Dilana, Snowdon e Turner, oggetto del progetto. È stato possibile in questo modo verificare che la varietà Dilana rosa era priva di virus ed è stata quindi risanata con successo; nelle altre varietà risultano invece presenti ancora due virus che comunemente infettano il crisantemo, ossia chrysantemum virus B e tomato spotted wilt virus. Queste varietà pertanto saranno soggette ad un nuovo ciclo di risanamento.
In conclusione, il progetto CRIREC ha permesso di:
- ampliare la nostra conoscenza del viroma del crisantemo, fornendo informazioni essenziali per la messa a punto di metodiche diagnostiche efficienti
- risanare la varietà Dilana rosa rendendola di nuovo disponibile per i floricoltori liguri
