Messa a punto di un sistema di diagnosi NGS in grado di ottenere informazioni sullo stato di infezione virale/viroidale di varietà di crisantemo importanti per il Ponente Ligure e di un sistema di protocollo per il risanamento di varietà a rischio di estinzione
Florcoop Sanremo / CREA-OF di Sanremo / IPSP-CNR di Torino
Programma Regionale di Sviluppo Rurale 2014-2020 della Regione Liguria – Misura 16.01
Aiuti per la costituzione e l’operatività dei gruppi operativi del PEI Attuazione del progetto dei Gruppi Operativi – 2° fase “Settore Agricolo”
Obiettivi del progetto sono quelli di recuperare, risanare e rendere disponibili per i coltivatori liguri varietà di crisantemo da fiore reciso molto appetibili dal punto di vista commerciale ma ormai scomparsi dai cataloghi di costitutori sia olandesi sia danesi. Ne sono un esempio le varietà di crisantemo Dilana, Snowdon e Turner le quali sono tuttora richieste dal mercato nazionale ma hanno perso le caratteristiche positive intrinseche della varietà a causa delle malattie virali diffuse dalla continua propagazione agamica.
Per risanare le varietà di crisantemo verranno effettuati:
- campionamenti per la diagnosi di virus e viroidi con tecniche di Next Generation Sequencing,
- prelievo del materiale vegetale per il risanamento. Le piante verranno poste in vitro, risanate con trattamenti termici, successivamente ambientate in una serra con rete insect proof per avere un pool di piante madri da utilizzare per la produzione di materiale agamico da dare ai floricoltori.
Entrando più nel dettaglio del processo di risanamento si è seguito il seguente protocollo:
- rilevamento dei virus e dei viroidi sulle varietà di interesse
- prelievo di porzione di fusto delle diverse varietà: i campioni sono stati suddivisi in microtalee di 3-5 cm con 1-3 gemme posti in acqua saponata per un primo lavaggio, disinfettati superficialmente con ipoclorito di sodio e successivamente risciacquati con acqua deionizzata sterile
- in seguito, i tessuti sono stati posti in tubi con 10 ml di substrato agarizzato
- gli espianti sono stati micropropagati in vitro con appositi substrati, sottoposti a termoterapia,
- i meristemi apicali sono stati prelevati micropropagati e, posti in radicazione su substrato MS, sono stati sottoposti ad un successivo controllo diagnostico per verificare l’assenza di virus
- il materiale esente da virus è stato sottoposto ad ambientamento in cella climatica
Al materiale vegetale oggetto di interesse, prima di essere sottoposto alle tecniche di risanamento, è stato applicato un sistema innovativo di diagnosi attraverso tecniche di Next Generation Sequencing. Le tecnologie di sequenziamento denominate NGS hanno avuto grande sviluppo in questi ultimi anni e, grazie alla continua diminuzione dei loro costi, stanno diventando la base per la messa a punto di nuovi approcci diagnostici per l’identificazione e la caratterizzazione degli agenti virali presenti nell’ospite anche a basse concentrazioni.
La tecnica del NGS è estremamente innovativa, valida e potente nell’identificare virus e viroidi, noti o nuovi, presenti in campioni vegetali, ed è correntemente utilizzata con successo per risolvere molte difficili problematiche riguardanti l’eziologia di patologie anche nel mondo vegetale. Esistono vari approcci basati sulle tecniche NGS, di particolare efficacia risulta essere il sequenziamento a partire dall’RNA totale estratto dai tessuti vegetali infetti, che si sta utilizzando in questo progetto, per la ricostruzione del viroma del crisantemo.
